摘 要：非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起豬的高傳染性疾病，嚴重威脅著我國養豬業的發展。該文從非洲豬瘟病原學、流行病學、臨床癥狀及診斷技術等方面進行綜述，以期為非洲豬瘟病毒準確、快速診斷和疫病凈化提供參考。

關鍵詞：非洲豬瘟；診斷技術；研究進展

非洲豬瘟（Africa swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（Africa swine fever virus，ASFV）引起的豬的一種急性、熱性和高度傳染性的疾病[1,2]，幾乎可以感染不同日齡的豬[3]。世界動物衛生組織（OIE）將其列為必須通報的疫病，我國動物防疫法將其列為I 類動物疫病[4]。由于ASFV 結構復雜，存活時間長，基因組龐大且易變異，而且其大多數蛋白結構與功能尚不清楚，以至于目前尚無有效的疫苗來預防ASFV[5,6]。當下除了要加快有效疫苗的研發，更重要的是利用準確、快速的診斷技術及時做出準確的診斷，對于非洲豬瘟病毒的防控和凈化具有重要意義。本文對非洲豬瘟及非洲豬瘟病毒診斷技術的研究進展進行綜述，以期為非洲豬瘟病毒準確、快速診斷和疫病凈化提供參考。

一、非洲豬瘟

1.病原學

非洲豬瘟病毒（ASFV）在病毒學分類上屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬，是ASFV 家族的*成員[7]。ASFV 是二十面體對稱結構的雙鏈DNA 病毒，大小在175～215nm，全基因組總長為175～190kb[8,9]。根據目前的有關研究，ASFV 共有24 個基因型和1 個血清型，在我國流行的是基因Ⅱ型、血清8 群[10,11]。根據該病毒致病力的不同，可分為感染無臨床癥狀毒株、低致病性毒株、中等毒力毒株、強毒力毒株[12]。其主要通過呼吸道和消化道侵染機體，使其免疫系統受損，進入血液后，引起組織器官出血[13]。

2.流行病學

豬是ASFV *的自然宿主，不同品種、不同日齡的豬均可感染。鈍緣蜱屬昆蟲是ASFV 的傳播媒介和貯藏寄主[14,15]，該病毒也是*以鈍緣蜱屬昆蟲為傳播方式的DNA 病毒[4]。該病毒主要通過直接或間接接觸帶毒豬的體液、排泄物以及血液等進行傳播[16]。目前尚未發現其能對人類以及其他動物具有感染性[17]。

3.臨床癥狀

豬一旦被ASFV 感染后，典型臨床癥狀表現為高熱、食欲下降、皮膚發紺、嘔吐、便血和共濟失調等，剖檢后會發現淋巴結、腎、胃腸黏膜等出血，甚至還伴隨呼吸障礙等特征[2,18-20]。毒株毒力不同，引起的臨床癥狀也不同，可分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型。強毒力毒株感染豬后，通常表現為最急性型或急性型。最急性型一般無明顯癥狀，病豬突然死亡。急性型的病豬主要特點為高熱、中度厭食、呼吸困難、便血、皮膚發紺等，處于妊娠期的母豬均會流產。并且強毒力毒株造成的病死率*可達*。中等毒力毒株主要引發非洲豬瘟亞急性型，其臨床癥狀與急性型相似，但程度相對較低，病死率一般為30%～70%。低毒力毒株主要引發非洲豬瘟慢性型，臨床癥狀表現為呼吸困難、濕咳、消瘦、關節腫脹等，病死率一般為10%～20%[21-23]。

二、非洲豬瘟診斷技術

1.病原學檢測

①病毒分離

采集病豬血液或器官組織對非洲豬瘟病毒進行分離，分離過程必須要在生物安全三級（包括三級）以上的實驗室進行。在病毒分離過程中，將*和培養液加到血液或研磨組織中，離心獲取上清液，通過病變效應、紅細胞吸附實驗、間接免疫熒光試驗等技術，確定豬是否感染非洲豬瘟[24,25]。

②紅細胞吸附試驗

紅細胞吸附試驗（HAD）早在1960 年就已經建立[24]。試驗時，將豬血液或組織制作的懸液接種在原代白細胞培養物中，鏡檢時，若出現有紅細胞吸附在感染細胞表面，呈玫瑰花環或桑葚狀現象，即可判定為陽性。該試驗較煩瑣且耗時長，對實驗環境及實驗操作人員的要求相對較高，具有一定的局限性[26,27]。

③ 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的原理是將抗體或抗原吸附在固相載體表面，檢測樣品中的抗原或抗體可與其特異性結合，形成抗原抗體復合物，將酶標抗體再與該復合物結合，根據加入底物的顏色反應即可判定結果[28]。隨著該技術不斷發展與應用，其檢測結果也更加準確而有效，具有方便、快速、設備儀器要求低、成本低等優點。但是與紅細胞吸附實驗相比，其靈敏性和特異性較低，檢測結果受樣本影響較大；與PCR相比，其特異性和靈敏性低，易出現假陽性；樣本易受保存環境溫度影響，檢測結果準確性不能得到保證[24]。

④ 熒光抗體試驗

熒光抗體試驗（FAT）是對病豬冰凍切片或者組織切片進行抗原檢測。檢測時，將病豬的冰凍切片、組織切片或已在載玻片上涂有已接種白細胞培養物的細胞沉淀干燥后，浸入丙酮中進行固定，用異硫氰酸熒光素標記抗非洲豬瘟病毒抗體，再用PBS 液沖洗后，在熒光顯微鏡觀察，如果胞漿中發現特異性熒光，判為陽性。該實驗具有很強的敏感性和特異性，可快速、簡便地得到非洲豬瘟病毒檢測的結果。但實驗對熒光素特異性要求較高，非特異性熒光素染色可能會造成假陽性的結果，對急性非洲豬瘟的靈敏度高。同時該實驗對操作人員的要求較高，并且需要借助顯微鏡，難以實現現場檢測，常作為檢測非洲豬瘟病毒的輔助方法[11,25]。

⑤聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（PCR），具有敏感、快速、特異性高的特點，同時對樣品的純度、血液樣品及組織的保存方式要求較低，被廣泛應用于非洲豬瘟病毒的檢測。Agüero 等[29]根據p72 保守基因序列，設計引物，建立了快速檢測ASFV 的PCR 方法，且該方法得到OIE 認證。但2015 年有相關研究認為，該方法在檢測中會出現假陰性結果[30]。為解決這個問題，Luo等根據p72 基因設計引物，檢測不同地區4 個基因型的14 個代表毒株，表明該方法更為靈敏、準確，能相對全面的檢測非洲豬瘟病毒[31]。

⑥ 多重PCR

此技術是在PCR 技術的基礎上建立并發展起來的，能在同一個反應體系中，同時加入多對引物，分別擴增到不同的靶標，獲得相應目的片段[32]。還能對DNA 和RNA 病毒進行同時檢測，效率較高，降低了試劑耗材成本。如五重RT-PCR 鑒別診斷方法，廣泛應用于動物疫病的檢測[33]。

⑦ 納米PCR

該技術是將納米金屬顆粒添加到普通PCR 反應中，使反應體系熱導性更強，PCR 反應更快，可提高反應的特異性，消除非特異性擴增，提高擴增產物產量，納米PCR 技術可使非洲豬瘟病毒檢測的靈敏度增加至1000 倍[34]。

⑧套式PCR

套式PCR 是先用外套引物進行一次擴增，再用內套引物對擴增產物進行第二次擴增，提高擴增的敏感性，該方法可從非洲軟蜱中檢測出非洲豬瘟病毒，可用于篩查不同種類蜱體內的非洲豬瘟病毒[35]。

⑨實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR 技術，是在PCR 體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監測PCR 反應過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析[36]。該技術與常規PCR 相比較，檢測過程簡化，可對多個樣品進行同時檢測，檢測的速度更快、靈敏度更高，并且特異性強、自動化程度高，有效解決常規PCR 污染等問題[37]。

⑩等溫擴增技術

等溫擴增技術是核酸體外擴增技術，其始終維持在恒定溫度進行反應。反應過程無需精密的儀器，具備恒溫裝備即可，并且操作簡便，反應時間短。不足的是缺乏熱循環中的變性、退火等程序，易出現假陽性，僅適用于疾病的初步篩查，在一定程度上限制了該技術的應用。且檢測試劑盒中酶的成本較高，造成單個樣品檢測費用比普通熒光PCR 高[38]。

2.血清學檢測

①酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是血清學檢測方法中應用最廣泛的檢測技術，具有快速、靈敏、成本低、特異性高、準確性高等特點，適用于大規模樣品的排查、疫病監測以及自動化血清學檢測。一般情況下，國內外常用p30/p32、p54、p72、p73 等作為檢測ASFV 抗體的蛋白，該方法可通過這些蛋白直接檢測出較低或中等毒力感染豬抗體[37]。王彩霞等[39]以ASFV p72 蛋白為包被抗原，建立阻斷ELISA 方法檢測豬血清中抗ASFV p72 蛋白的抗體，對ASFV 陽性血清靈敏度*為1∶128，具有較高的特異性、敏感性和良好的重復性。

②膠體金試紙檢測技術

膠體金試紙檢測技術是將特異性抗原或抗體與膠體金結合，形成膠體金免疫復合物，膠體金聚集于檢測線顯色，通過觀察顯色反應，即可判定結果。該技術可通過目測法判斷結果，不需要專業的儀器設備，具有操作簡單，特異性、靈敏度高等特點，適合現場、基層、大規模排查或是生豬調運臨場的使用[40]。張鑫宇等[2,41]于2014 年以非洲豬瘟p54 的重組蛋白為核心蛋白標記膠體金，再分別用葡萄球菌A 蛋白和抗p54 多抗作為檢測線和質控線，按一定順序制備非洲豬瘟p54 抗體膠體金試紙，建立了p54 抗體膠體金檢測法，該試紙與豬的其他病毒抗體陽性血清無交叉反應，表明該檢測法的敏感性和特異性高。

③間接免疫熒光試驗

間接免疫熒光試驗是利用特異性抗體和樣品中相應抗原反應，形成抗原抗體復合物，再用熒光標記的第二抗體與抗原抗體復合物結合，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察熒光。該試驗敏感度高，但對試驗條件及操作要求較高，常用于復核ELISA 檢測中的可疑樣品[24,37,40]。

三、小結

非洲豬瘟是我國重點防范的外來疫病之一，在全球已流行一百多年。自2018 年我國首次發生非洲豬瘟以來，我國生豬養殖業以及人們的日常生活都受到了嚴重的影響。目前尚無疫苗和藥物可用于預防和治療非洲豬瘟，因此，快速、有效、科學的診斷技術對非洲豬瘟防控尤為重要。該文從非洲豬瘟病原學、流行病學、臨床癥狀及診斷技術等方面進行了綜述，以期各個地區能根據實際情況，綜合各種方法的優缺點，選擇適當的方法進行檢測。同時科研單位也應根據目前診斷技術的不足，加大力度研發更佳的診斷方法。